Что такое молочнокислые бактерии незаквасочного происхождения и как они влияют на качество сыра?
Микрофлору сыра с практической точки зрения удобно разделить на две крупные группы:
— микроорганизмы заквасок;
— микроорганизмы, не входящие в состав заквасок.
Основное отличие между этими двумя группами состоит в том, что культуры заквасок продуцируют кислоту во время процесса выработки, тогда как деятельность вторичной микрофлоры в этот период незначительна. В состав дополнительной микрофлоры входят разнообразные микроорганизмы, в том числе:
— пропионовокислые бактерии;
— плесени;
— микрофлора слизи;
— МКБ, не входящие в состав закваски (NSLAB).
К последней группе относятся факультативно гетероферментативные мезофильные лактобациллы, педиококки, энтерококки и лейконостоки. Мезофильные лактобациллы являются наиболее хорошо изученными представителями этой группы, тем не менее другие упомянутые виды также являюся важной частью этой группы в связи с тем, что они являются молочнокислыми бактериями, обнаруживаются в сыре и не вносят существенного вклада в кислотообразование на стадии изготовления сырного сгустка. Представители этих МКБ, в частности мезофильные лактобациллы, были выделены из всех зрелых сыров. За исключением лейконостоков, которые преднамеренно вносят в некоторые виды сыра, NSLAB являются случайными микроорганизмами, которые попадают в сырную массу из молока, ингредиентов или оборудования, используемым в изготовлении сыра. Их роль в процессе созревания была предметом большого числа исследований, тем не менее их вклад в качество сыра не вполне ясен, за исключением лейконостоков, которые ответственны за образование глазков в результате продуцирования СО2 и за формирование вкуса и аромата в результате продуцирования диацетила и ацетата в некоторых видах сыра.
МКБ незаквасочного происхождения
Мезофильные лактобациллы
Род Lactobacillus состоит из грамположительных, каталазо-отрицательных, чаще всего неподвижных палочковидных бактерий со смешанными потребностями в питании. Длина и форма клеток может существенно различаться в зависимости от вида и штамма — от длинных тонких палочек до коротких клеток в форме коккобацилл. Палочки могут быть прямыми или искривленными, обычно они образуют цепочки. Лактобациллы, как правило, являются ацидофильными бактериями, их оптимальное значение рН обычно находится в диапазоне от 5,5 до 6,2. Они способны расти при температуре от 2 до 53 °С.
Этот род можно разделить на три группы:
— облигатно-гомоферментативные бактерии;
— факультативно-гетероферментативные бактерии;
— облигатно-гетероферментативные бактерии.
Мезофильные лактобациллы, наиболее часто встречающиеся в сыре в составе комплекса NSLAB, являются представителями факультативно-гетероферментативной группы лактобацилл. В связи с этим их иногда называют факультативно-гетероферментативными лактобациллами (ФГФ-лактобациллами). Хотя из сыра был выделен широкий спектр видов, наиболее часто в нем встречаются бактерии Lactobacillus casei/ Lactobacillus paracasein Lactobacillus plant arum, Lactobacillus rhamnosus и Lactobacillus curvatus.
Педиококки
Род Pediococcus состоит из грамположительных, каталазо-отрицательных, неподвижных сферических клеток, которые обычно образуют пары и тетрады. Единичные клетки встречаются редко, цепочек педиококки не образуют. Они в большинстве своем являются факультативными анаэробами и растут в температурном диапазоне 25—50 °С. Представители этого рода устойчивы к соли, причем некоторые штаммы способны развиваться в среде, содержащей до 6,5% NaCl, рост педиококков происходит в широком диапазоне значений рН — от 4,5 до 8,2. Из молочных продуктов выделяют в основном Pediococcuspentosaceus и Pediococcus acidilactici.
Энтерококки
Род Enterococcus состоит из грамположительных, каталазо-отрицательных, сферических или овальных неподвижных клеток, которые, как правило, располагаются парами или цепочками. Они являются факультативными анаэробами, большинство видов данного рода обычно растут в температурном диапазоне 10—45 °С. Большинство их способно к росту в среде, содержащей до 6,5% NaCl, при значении рН 9,6, а также могут гидролизовать эскулин в присутствии 40%-ных желчных солей. Среди видов, выделяемых из сыра, превалируют Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis и Enterococcus durans.
Лейконостоки
Род Leuconostoc состоит из грамположительных, каталазо-отрицательных, неподвижных клеток с неправильной коккоподобной морфологией. Их оптимальная температура роста находится в диапазоне от 20 до 30 °С. У них много общих характеристик с лактококками, но имеются и отличия:
— лейконостоки сбраживают сахара гетероферментативно, а не гомоферментативно:
— они продуцируют D-, а не L-изомеры лактатов;
— все виды, кроме Leuconostoc lactis, хорошо растут в лакмусовом молоке, за исключением сред, в которые добавлен дрожжевой экстракт (0,3 г/100 мл).
Наиболее часто в сыре встречаются Leuconostoc mesenteroides подвид cremoris и Leuconostoc lactis.
Источники NSLAB
Большинство NSLAB являются случайными бактериями, которые попадают в сыр либо из ингредиентов, используемых в его производстве, либо из окружающей среды. Исключением являются лейконостоки, которые иногда вносят в составе заквасочных культур. Кроме того, в результате накапливающихся экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что некоторые штаммы мезофильных лактобацилл обладают способностью усиливать вкус сыра, в нстоящее время вместе с заквасками иногда добавляют специально подобранные штаммы лактобацилл. Мезофильные лактобациллы могут быть выделены из сырого молока, следовательно, молоко является их наиболее вероятным источником, особенно в отношении сыров, изготавливаемых из сырого молока. Термочувствительность мезофильных лактобацилл была изучена достаточно подробно, но полученные данные неоднозначны. В целом результаты исследований подтверждают, что во время термической обработки имеет место значительная инактивация большинства исследованных штаммов; однако достаточно вероятно выживание небольшого числа некоторых штаммов, хотя и в состоянии стресса. Такие штаммы, скорее всего, во время выработки сыра и его созревания восстанавливаются и затем растут в сырной массе.
Лактобациллы, которые попадают на сыродельное предприятие либо с молокомсырьем, либо в составе других ингредиентов, с оборудования или от персонала, могут выживать в форме биопленок. Такие биопленки могут быть устойчивы к используемым способам мойки и, возможно, способны выживать в течение длительного времени внутри предприятия. По источникам педиококков никаких данных не опубликовано, но, скорее всего, пути их попадания в сыр совпадают с лактобациллами.
Для сыра источник энтерококков, как и в случае лактобацилл, также установлен не вполне достоверно. Однако в целом принято, что источником энтерококков является молоко, так как оно может легко контаминироваться в процессе доения —энтерококки могут быть легко выделены из коровьих экскрементов. Однако другие микроорганизмы, присутствующие в экскрементах, далеко не всегда обнаруживаются в молоке в больших количествах, что наводит на мысль о необходимости рассматривать и другие источники попадания данных микроорганизмов в молоко, помимо экскрементов.
Рост NSLAB
Факторы, которые влияют на рост микроорганизмов в сыре, были рассмотрены в вопросе. Они включают в себя рН, содержание соли, активность воды и температуру. Хотя сочетание этих факторов используют для подавления роста большинства микроорганизмов, многие NSLAB, в частности лактобациллы и энтерококки, являются устойчивыми к таким условиям обитания и обычно выживают и продолжают свой рост во время созревания сыров. Многие исследования продемонстрировали способность «диких» лактобацилл расти во время созревания сыра вплоть до достижения их численности 107 КОЕ/г в течение первых 2—3 мес. созревания. Несмотря на то что энтерококки были выделены из многих видов сыра, большинство данных по изменениям их популяции во время созревания подтверждают, что в целом ее
численность остается стабильной во время созревания. То же самое можно сказать и в отношении лейконостоков. О росте педиококков в сыре имеются лишь немногочисленные данные; однако тот факт, что их иногда выделяют из образцов зрелого сыра, в которых они не обнаруживались в начале созревания, свидетельствует, что существует возможность роста этих микроорганизмов.
Скорость роста и конечная численность популяции лактобацилл незаквасочного происхождения не обнаруживают существенной изменчивости во всем диапазоне значений рН, концентраций соли и влажности, которые имеют место в сгустке во время изготовления сыра и созревания. Время генерации этих лактобацилл в сыре, созревающем при 6 °С, составляет приблизительно 8,5 сут, их жизнеспособные
клетки могут быть выделены из сыра, хранившегося при 10 °С в течение 3 лет. Хотя скорость роста лактобацилл незаквасочного происхождения зависит от температуры, на их конечную численность в сыре температурные колебания оказывают незначительное воздействие.
Сыр является богатым источником многих питательных веществ, необходимых для роста микроорганизмов, однако очевидно, что углеводы, необходимые в качестве источника энергии, являются лимитирующим фактором. Лактоза, которая в избытке присутствует в молоке, в сыре содержится в относительно низких количествах и к тому же только в свежем сгустке. Она, скорее всего, используется бактериями закваски или незаквасочными лактобациллами в первые дни созревания; однако значительный рост этих микроорганизмов, имеющий место после истощения лактозы, указывает на то, что в сыре должны присутствовать альтернативные источники углеводов. Последние исследования подтвердили наличие у лактобацилл незаквасочного происхождения фермента гликозидгидролазы, в связи с чем эти микроорганизмы могут утилизировать сахара, отщепляемые от гликомакропептида казеина и гликопротеинов мембран глобул молочного жира. Также предполагается, что источником углеводов являются сахара, высвобождающиеся из клеток заквасочных культур вследствие их автолиза. При наличии у лактобацилл акцептора кетокислоты, необходимого в качестве Со-фактора для аминотрансферазной активности, эти бактерии способны разлагать пептиды и аминокислоты. В связи с этим недавно было высказано предположение, что в сыре в роли одного из главных источников энергии для лактобацилл незаквасочного происхождения может выступать аргинин.
Влияние NSLAB на качество сыра
Влияние NSLAB на качество сыра было объектом многих исследований. Наметились два основных подхода к данной проблеме:
— попытки контролировать поступление и рост NSLAB в сыре;
— внесение специально подобранных штаммов, чтобы обеспечить их преобладание в сыре во время созревания и, следовательно, возможность отследить любое последующее влияние на качество.
Такого рода исследования усложняются тем, что сочетание видов МКБ является случайным, и успешный контроль над их популяцией во время длительного созревания был достигнут лишь в нескольких работах.
Во многих исследованиях во избежание попадания случайных МКБ в сыр обеспечивали выполнение строгих санитарно-гигиенических требований, особенно при проведении лабораторных и опытных выработок. Это положительно сказалось на уровне лейконостоков и энтерококков, однако добиться снижения количества
лактобацилл оказалось более сложным. Тот факт, что незаквасочные лактобациллы распространены повсеместно и не испытывают проблем при росте в сыре, представляет собой особую трудность для этого направления исследований. Санитарно-гигиенические мероприятия заключались в стерилизации перед выработкой всего оборудования и инструментов, используемых при изготовлении сыра, более жестких режимах пастеризации молока и в предупреждении контаминации из окружающей среды во время выработки. Интерпретация результатов таких исследований усложняется тем, что полный контроль лактобацилл незаквасочного происхождения достигался довольно редко; тем не менее большинство исследователей пришли к выводу, что эта группа бактерий играет определенную роль в формировании качества сыра.
Также были предприняты попытки контролировать численность микрофлоры незаквасочного происхождения посредством внесения антибиотиков в сырный сгусток в конце его изготовления или путем использования заквасочных культур, продуцирующих бактериоцин. При внесениии антибиотиков рост незаквасочных лактобацилл существенно снижался, хотя не подавлялся полностью. В целом ход протеолиза, считающийся важным фактором для качества сыра, при обработке антибиотиками существенно не менялся, однако имеются сведения о более низком уровне аминокислот в сыре, содержащем антибиотики. Бактериоцины, которые продуцировались заквасочной культурой внутри сыра, являются альтернативой антибиотикам для контроля роста вторичной микрофлоры. Лактицин 3147, который является бактериоцином широкого спектра действия и может образовываться в результате активности заквасочных культур в сыре во время его изготовления, имеет способность подавлять рост незаквасочных лактобацилл. Как и в случае использования антибиотиков, эти лактобациллы продолжали развиваться в сыре, содержащем лактицин 3147, хотя скорость их роста и размер конечной популяции были
меньше. В этих исследованиях было отмечено небольшое влияние подавляемой популяции Lactobacillus на качество сыра.
Для регулирования численности МКБ, не входящих в закваски, изменяли температуру созревания. До настоящего времени, несмотря на то что снижение температуры созревания подавляет рост лактобацилл незаквасочного происхождения, полностью избавиться от них таким способом не удалось ни в одном исследовании, даже при снижении температуры до 1 °С.
Воздействие внесения в молоко дополнительных культур, содержащих не входящие в состав заквасок лактобациллы, изучалось в течение нескольких десятилетий. Полученные результаты неоднозначны — одни исследования выявили положительный эффект, тогда как в других отмечено отрицательное воздействие на формирование вкуса и аромата. Такие разногласия, вероятно, являются следствием способности вностимых изолированных штаммов изменять формируемый вкус и аромат при совместном росте со случайными штаммами во время созревания. Тем не менее большинство более современных исследований по этой теме показали, что добавки незаквасочных Lactobacillus оказывают положительный эффект на вкус и способствуют предупреждению некоторых пороков, например, связанных с газообразованием гетероферментативных лактобацилл во время созревания.
Возможное влияние педиококков на качество сыра не вполне изучено в первую очередь в связи с редкостью их присутствия в сыре. В различных штаммах было выявлено наличие ферментов, проявляющих протеазную, пептидазную и липазную активности, т. е. имеющих потенциальную возможность способствовать созреванию сыра. Для выявления их роли в формировании вкуса требуются дальнейшие
исследования распространенности педиококков, особенностей их роста и выживания во время созревания сыра.
Влияние энтерококков на качество сыра также неясно. Несомненно, их присутствие в сыре может рассматриваться как индикатор неудовлетворительных санитарно-гигиенических условий во время производства и обработки молока. Хотя большинство изученных штаммов имеют относительно низкую внеклеточную протеолитическую активность, многие из них проявляют существенную липолитическую активность в сочетании со способностью метаболизировать цитрат, что может иметь результатом продуцирование вкусоароматических соединений сыра.
Возможность лейконостоков влиять на процесс созревания сыра вполне подтверждена документально. Они продуцируют ацетат, СО2, диацетил, ацетоин и 2,3-бутандиол, образующийся в результате метаболизма цитратов. Продуцируемый С02 обеспечивает образование мелких глазков в Голландских сырах, таких как Эдам и Гауда, тогда как диацетил и ацетат участвуют в формировании вкуса и аромата продуктов, таких как сыры Кварк, Фромаж Фре и Коттедж. Кроме того, в этих микроорганизмах присутствуют внутриклеточные ферменты, обладающие протеолитической и эстеразной активностью, что, вероятно, влияет на процесс созревания.
Внесение NSLAB для улучшения качества сыра
Появление все новых данных о положительном влиянии NSLAB на качество сыра обусловило расширение исследований, направленных на поиск и идентификацию соответствующих штаммов. Внесение этих штаммов при выработке сыров могло бы дать значительный экономический эффект. Важным свойством NSLAB и, в частности, лактобацилл является их способность к росту в сыре во время созревания, что
позволяет добавлять их к нормализованной смеси в очень малых количествах, но при этом достигать положительного воздействия на сыр. Для осуществления такого приема ключевым моментом является тщательный подбор соответствующих штаммов, так как во многих исследовательских работах выявлены отдельные штаммы, которые могут оказывать положительное или отрицательное воздействие на качество готового продукта.
Один из подходов к данной проблеме заключается в установлении «эталонной микрофлоры» путем выделения смешанных культур МКБ либо из сырого молока, либо из сыра хорошего качества. Такие культуры были выделены посевом в чашки с селективной средой, или, в случае молока, ультрафильтрацией. Результаты получились разноречивые — некоторые авторы отмечали улучшение, тогда как другие сообщали о негативных эффектах.
Альтернативный подход состоит в подборе отдельных штаммов для внесения в нормализованную смесь. Опубликовано большое количество работ, описывающих применение этого подхода. Большинство исследований заключалось в подборе штаммов из сыров высокого качества с последующим внесением посевного материала в нормализованную смесь. Результаты также оказались неоднозначными. Последние исследования показали, что популяция лактобацилл, не входящих в закваски, является динамичной — в ходе созревания лишь в немногих сырах преобладают отдельные штаммы или группы штаммов. Таким образом, отбор штаммов, выделенных в определенный момент периода созревания, может не охватить все
штаммы, необходимые для улучшения качества. Критерии отбора штаммов, особенно в ранних исследованиях в этой области, ограничивались минимальным диапазоном биохимических характеристик. В современных исследованиях для характеристики штаммов используют молекулярные методы и учитывают намного больше биохимических признаков. Результатом таких исследований является идентификация смеси тех штаммов, для которых доказана способность повышать качество сыра. Это показывает, что систематический подход к отбору штаммов, основанный на современном уровне знаний о физиологии микроорганизмов, микробиологии сыра и биохимии развития вкуса и аромата, позволяет осуществить отбор штаммов лактобацилл незаквасочного происхождения и обладающих потенциальной возможностью улучшать качество сыра.
Исследования по селекции других МКБ в целях их использования в качестве добавок к закваскам не столь обширны, но в большинстве случаев использовали подходы, подобные тем, которые использовались для селекции лактобацилл, не входящих в закваски. Педиококки в этих исследованиях были выделены из сырого молока и сыра, тогда как энтерококки — из нативных культур сыворотки и сыра.
Выводы
Комплекс NSLAB сыра состоит из лактобацилл, педиококков, энтерококков и лейконостоков. Данную группу МКБ отделяют от заквасочных бактерий на основании того, что они не продуцируют значительного количества кислоты на стадии выработки, но могут расти и/или выживать в сыре на протяжении длительного периода созревания. Их популяция достаточно сложна, она состоит из множества видов и штаммов, которые находятся в динамическом состоянии во время созревания. Контроль NSLAB, особенно лактобацилл, затруднен, и, несмотря на то что соблюдение строгих санитарно-гигиенических требований может ограничить начальное количество, они в конечном счете растут даже в сырах, которые выдерживаются при низкой температуре, и достигают в них численности свыше 107 КОЕ/г. Появляется все больше доказательств того, что NSLAB способны влиять на качество сыра. Для реализации экономического потенциала этих бактерий ключевой проблемой является отбор штаммов, пригодных для использования в качестве добавок к закваскам.
